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      產品資料

      什么是非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

      上傳時間:2023/11/12 來源:易買儀器網 點擊:

      1 儀器:垂直系列電泳槽;低、中、高壓電源;恒溫循環器

      2 試劑: 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、 考馬斯亮藍\硝酸銀、凝膠緩沖液、非變性上樣緩 沖液、Tris堿、甘氨酸等

      聚丙烯酰胺凝膠電泳

      變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 儀器:垂直系列電泳槽;低、中壓電源、恒溫循環器 2 試劑: 丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺, SDS( 十二烷基硫 酸鈉)溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8)、0.5MTris- HCl(pH6.8)、TEMED、10%(w/v)過硫酸胺溶液、SDS- Page上樣緩沖液:( 0.5M Tris( pH6.8)緩沖液、甘油、 10%SDS 、二硫蘇糖醇、溴酚藍)、Tris、甘氨酸、SDS 、考馬斯亮藍 \硝酸銀等

      SDS-Page,在蛋白質裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT

      巰基乙醇或DTT可使蛋白質分子中二硫鍵還原,使多肽分成單個亞單位。

      SDS-PAGE時,在蛋白質裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

      PAGE據其有無濃縮效應,分為連續系統與不連續系統

      連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同,帶電顆粒在電場作用下,主要靠電荷及分子篩效應; 不連續系統電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續性,帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應,還具有濃縮效應,故分離效果更好。 不連續的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質,利用凝膠層的不連續性、緩沖液離子的不連續性、PH的不連續性及電位梯度的不連續性,使樣品在不連續的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區帶,然后進行分離。

      樣品濃縮效應

      1) 凝膠孔徑的不連續性: 濃縮膠為大孔膠;分離膠為小孔膠。在電場作用下,樣品顆粒在 大孔膠中泳動的阻力小,移動速度快;當進入小孔膠時,受到的阻 力大,移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處,樣品遷移受阻而壓 縮成很窄的區帶。

      2) 電位梯度的不連續性: 電泳開始后,快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低 的低電導區,使局部電位梯度增高,將蛋白質濃縮成狹窄的區帶

      緩沖體系離子成分及pH值的不連續性

      Tris:緩沖配對離子,維持溶液的電中性及pH值 Cl-: 在電場中遷移率快,前導離子(leading ion),快離子。 Gly:其pI =6.0,在pH6.8的濃縮膠緩沖體系中,甘氨酸解離度很小,因而在 電場中遷移很慢,稱為尾隨離子(trailing ion),慢離子。當進入 pH8.8的分離膠時,甘氨酸解離度增加,其有效遷移率超過蛋白質;因此 Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續前進。高電勢梯度不存在了,各種蛋 白質僅會由于其分子量或構型的不同,在一個均一的電勢梯度和pH條件 下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同,表現的泳動率的不同 被分開 大多數蛋白質在pH6.7或8.3時均帶負電荷,在電場中,都向正極移動。

      分子篩效應

      大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時,受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率 ,這就是分子篩效應。

      電荷效應

      蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質區,但由于每種蛋白質分子所帶有效電荷不同,因而泳動率也不同,因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排列成一個一個區帶。在進入分離膠時,電荷效應仍起作用。 目前,PAGE連續體系應用也很廣,雖然電泳過程中無濃縮效應,但利用分子篩及電荷效應也可使樣品得到較好的分離,加之在溫和的pH條件下,不致使蛋白質、酶、核酸等活性物質變性失活,也顯示了它的優越性。

      PAGE電泳據電泳裝置不同分為圓盤及垂直的板狀兩種

      前者凝膠是在玻璃管中聚合,樣品分離區帶染色后呈圓盤狀,因而稱為圓盤電泳; 后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合,故稱為垂直板狀電泳。兩者電泳原理完全相同。

      蛋白質進行PAGE時,常用垂直板電泳。

      垂直板電泳的優越性有:

      表面積大而薄,便于通冷卻水以降低熱效應,條帶更清晰。

      在同一塊膠板上可同時進行10個以上樣品的電泳,便于在同一條件下比較分析鑒定,還可用于印跡轉移電泳及放射自顯影。

      膠板制作方便,易剝離,樣品用量少,分辨率高,不僅可用于分析,還可用于制備。

      膠板薄而透明,電泳染色后可制成干板,便于長期保存與掃描。

      可進行雙向電泳。


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